Окончив в 1949 г. среднюю школу, Гилберт поступил в Гарвардский университет, где в 1954 г. получил степень магистра физики. Затем он переехал в Англию, работал в Кембриджском университете. В 1957г. получил степень доктора математики, после чего вернулся в Гарвард, работал научным ассистентом Джулиуса Швингера.

В 1960 г. на работу в Гарвард перешёл один из первооткрывателей ДНК Джеймс Уотсон. Дружеские отношения, а затем и научное сотрудничество с Уотсоном расширили сферу научных интересов Гилберта в сторону молекулярной биологии. В 1964 г. он ушёл с физического факультета, получив должность адъюнкт-профессора на биофизическом факультете.

Вместе с Аланом Мексемом Гилберт разработал новый метод секвенирования ДНК. В 1978 г. он участвовал в создании фирмы “Биоген”, одной из первых компаний, специализирующихся в области генной инженерии, а в 1981 году был избран её президентом. В 1984 г. Гилберт вернулся в Гарвардский университет и продолжил свои исследования по структуре гена и синтезу белков в рекомбинантных организмах.

В 1979 г. Уолтер Гилберт вместе с Фредериком Сенгером получил премию Луизы Гросс Горвиц. В следующем 1980 году вместе с тем же Сенгером он получил Нобелевскую премию по химии “за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах”, которую они разделили с Полом Бергом. Их открытия позволили организовать производство человеческих гормонов с помощью бактерий.

Гилберту присуждены почётные научные звания Чикагского, Колумбийского и Рочестерского университетов, ряд престижных премий. Он является членом американской Национальной академии наук и нескольких научных обществ.

Английское имя Уолтер в переводе  с древнегерманского означает "полководец". Фамилия (и имя) Гилберт происходит от германских элементов gisil - "обет" и beraht - "яркий".